液氮超低溫保藏法是目前保存微生物菌種最可靠的方法，多數(shù)國(guó)家級(jí)菌種保藏單位都采用此法。

　　1、準(zhǔn)備安培管

　　用于液氮保藏的安培管，要求能耐受溫度突然變化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸鹽玻璃制造的安培管。安培管的大小通常使用75×10mm的安培瓶。

　　2、加保護(hù)劑與滅菌

　　保存細(xì)菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的細(xì)胞時(shí)，則將空安培管塞上棉塞，在壓力0.11MPa，溫度121℃條件下滅菌15min;若保存霉菌菌絲體則需在安培管內(nèi)預(yù)先加入保護(hù)劑，如10%的甘油蒸餾水溶液或10%二甲亞砜蒸餾水溶液，加入量以能浸沒(méi)以后加入的菌種塊為限，而后再進(jìn)行高壓滅菌。

　　3、接入菌種

　　將菌種用10%的甘油蒸餾水溶液制成菌懸液，裝入已滅菌的安培管;霉菌菌絲體則可用滅菌打孔器，從平板內(nèi)切取菌落圓塊，放入含有保護(hù)劑的安培管內(nèi)，然后用火焰熔封。浸入水中檢查有無(wú)漏洞。

　　4、凍結(jié)

　　再將已封口的安培管以每分鐘下降1℃的慢速凍結(jié)至-30℃。若細(xì)胞急劇冷凍，則在細(xì)胞內(nèi)會(huì)形成冰的結(jié)晶，因而降低存活率。

　　5、保藏

　　經(jīng)凍結(jié)至-30℃ 的安培管立即放入液氮冷凍保藏器的小圓筒內(nèi)，然后再將小圓筒放入液氮保藏器內(nèi)。液氮保藏器內(nèi)的氣相為-150℃，液態(tài)氮為-196℃。

　　6、恢復(fù)培養(yǎng)

　　保藏的菌種需要用時(shí)，將安培管取出，立即放入38～40℃的水浴中進(jìn)行急劇解凍，直到全部融化為止。再打開(kāi)安培管，將內(nèi)容物移到適宜的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

　　此法除了適宜于一般微生物的保藏外，對(duì)于一些用冷凍干燥法都難以保藏的微生物如支原體、衣原體、氫細(xì)菌、難以形成孢子的霉菌、噬菌體及動(dòng)物細(xì)胞都可長(zhǎng)期保藏，而且不易發(fā)生變異。缺點(diǎn)是需要特殊設(shè)備。